Исследователи обнаружили скрытый мир живых клеток в грудном молоке человека

Живые клетки женского молока не только делят одну и ту же жидкость. Некоторые иммунные клетки концентрируют углерод из сахара внутри капель жира, в то время как некоторые клетки, производящие молоко, накапливают больше материала из строительных блоков белка. Новое исследование изображений раскрывает эти различия в необычайно мелких деталях, что дает ученым более близкое представление о клеточной активности в молоке.

Исследование, соавтором которого являются ученые-биомедики из Университета Западной Австралии и опубликованное в журнале ACS Nano, сочетает в себе несколько методов визуализации с отслеживанием питательных веществ. Его вклад выходит за рамки определения того, какие клетки присутствуют. Этот подход связывает идентичность клеток с внутренними структурами и химическими картами, помогая выявить, как разные клетки обрабатывают питательные вещества в лабораторных условиях.

Уже было известно, что грудное молоко содержит живые клетки, в том числе лактоциты, продуцирующие молоко, и несколько типов иммунных клеток. Что оставалось трудным, так это увидеть их внутреннюю организацию наряду с их метаболической активностью с достаточной пространственной детализацией, чтобы локализовать сигналы, полученные от питательных веществ, внутри отдельных клеточных компартментов. Обилие жиров и разнообразный состав молока усложняют эту задачу, скрывая детали, которые обычное клеточное профилирование не может полностью уловить.

Ведущий автор Цюнсян, известный как Линн, Лин — докторант, изучающий эту клеточную сложность. «Благодаря нашему новому подходу мы можем заглянуть внутрь отдельных клеток на наноуровне и начать понимать, как связаны их структура, химический состав и метаболизм», — сказала она. Эти связи имеют значение, поскольку клетки со схожими характеристиками могут работать по-разному.

Команда объединила конфокальную микроскопию, электронную микроскопию и наномасштабную масс-спектрометрию вторичных ионов (NanoSIMS). В конфокальной визуализации используются флуоресцентные маркеры, помогающие идентифицировать типы клеток, тогда как электронная микроскопия выявляет гораздо меньшие внутренние структуры. NanoSIMS отображает элементы и изотопы, которые представляют собой формы элемента с разным количеством нейтронов.

Каждый метод отвечает на отдельный вопрос о клетке. Располагая одни и те же клетки на изображениях, исследователи смогли связать их идентичность с такими особенностями, как капли жира и концентрации химических веществ. Сетчатые поверхности помогли выровнять измерения, уменьшив неопределенность, которая могла возникнуть при сравнении несвязанных клеток, просмотренных с помощью разных инструментов.

Полученное структурное исследование включало лактоциты, макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки. Последние три относятся к иммунной системе, хотя их роли и внутренняя организация различаются. Структурный анализ включал образцы от пяти участников, в то время как измерения отслеживания питательных веществ проводились от двух доноров, что является важным ограничением того, насколько широко могут быть применены результаты.

Чтобы исследовать метаболизм, команда добавила глюкозу, содержащую стабильный изотоп углерода, в свежесобранные образцы молока. Эта метка позволила им отследить, где накапливался углерод, образующийся в сахаре. Через 30 минут NanoSIMS обнаружил заметно разные модели маркировки среди макрофагов, иммунных клеток, которые могут поглощать материал и помогать координировать иммунные реакции.

Некоторые макрофаги имели гораздо более сильную углеродную маркировку внутри своих липидных капель, чем другие. Эти капли представляют собой клеточные отсеки, в которых хранятся жиры, что делает их структуру соответствующей активной обработке липидов. Результат показывает, что молочные макрофаги метаболически различаются, а не являются однородной популяцией, выполняющей одну и ту же работу с одинаковой скоростью.

Однако изображения не позволяют точно установить, как меченый углерод попал в эти капли. NanoSIMS идентифицирует обогащение изотопов, а не конкретные молекулы, несущие его. Дополнительные биохимические измерения потребуются, чтобы отличить вновь синтезированный жир от ремоделирования липидов или других путей, поэтому полученные результаты нельзя рассматривать просто как доказательство того, что сахар стал новым жиром.

В ходе того же эксперимента в каплях жира лактоцитов было выявлено незначительное количество меток, полученных из глюкозы. Этот контраст предполагает различные краткосрочные модели обращения с питательными веществами между этими популяциями клеток. Это не означает, что лактоциты никогда не используют глюкозу, поскольку эксперимент охватывал только определенный период отслеживания и набор лабораторных условий вне организма.

Второй эксперимент проводился с аминокислотами, строительными блоками белков, с использованием стабильного изотопа азота. Исследователи исследовали маркировку в течение интервалов от нуля до 30 минут. Отдельные лактоциты накапливали разное количество метки, обнаруживая различия даже внутри популяции клеток, связанных с выработкой компонентов молока.

Этот вариант дает более подробную картину, чем рассмотрение всех лактоцитов как одинаково активных. Некоторые клетки показали значительно большее накопление азота, полученного из аминокислот, чем другие. Однако измерения не позволяют отличить азот, включенный в состав вновь созданных белков, от свободных аминокислот или других азотсодержащих молекул внутри клеток.

Ученые также повторно проанализировали общедоступный набор данных секвенирования одноклеточной РНК, чтобы изучить активность генов. Этот метод измеряет сообщения РНК, связанные с экспрессируемыми генами. Группы лактоцитов с более сильными признаками метаболизма аминокислот также продемонстрировали закономерности, связанные с синтезом белка, секрецией, производством энергии и метаболизмом липидов, что соответствует их установленной секреторной роли.

Важно отметить, что эти измерения РНК были получены из отдельного набора данных, а не из точных клеток, отображаемых во время отслеживания питательных веществ. Таким образом, два подхода предоставляют взаимодополняющие доказательства, а не прямую молекулярную запись каждой сфотографированной клетки. Вместе они поддерживают метаболическое разнообразие лактоцитов, не устанавливая точно, сколько молочного белка производит каждая изображенная клетка.

Нейтрофилы стали еще одним примером того, как внутреннюю структуру и химию можно изучать вместе. NanoSIMS обнаружил обогащение серой и железом во внутриклеточных гранулах — небольших отсеках, которые могут нести противомикробный материал. Эти элементарные сигнатуры соответствуют известным особенностям защиты нейтрофилов, хотя они не идентифицируют конкретные задействованные белки.

Профессор Донна Геддес, директор Центра исследований и трансляции лактации человека UWA, подчеркнула значимость этих иммунных клеток для защиты от инфекций. Исследование дает возможность более внимательно изучить их содержание. Он не проверял напрямую, убивали ли измеренные гранулы бактерии или изменял ли их состав уровень инфицирования младенцев.

Подготовка проб также оказалась важной для интерпретации клеточной биологии. Лактоциты, прикрепленные к покровным стеклам, демонстрировали нарушенную внутреннюю структуру, даже когда знакомые клеточные маркеры оставались обнаруживаемыми. Команда провела метаболическое отслеживание свежевыделенных клеток в суспензии, чтобы уменьшить эффекты, связанные с прикреплением и культивированием, подчеркнув, как обращение с ними может повлиять на результаты эксперимента.

По мнению доктора Кая Чена из Школы биомедицинских наук UWA, объединение этих методов дает возможность связать структуру клетки с функцией. Платформа может помочь ученым исследовать различия, которые остаются скрытыми, когда клетки подсчитываются или классифицируются отдельно. Более масштабные исследования должны будут определить, насколько последовательно эти метаболические закономерности проявляются у разных людей и на протяжении всего периода лактации.

Доцент К. Сваминатан Айер, директор Учебного центра биомедицинского анализа ARC, определил гестационный диабет как будущий исследовательский интерес. В данном исследовании остается без ответа вопрос о том, изменяет ли это состояние метаболизм молочных клеток. Для его тестирования потребуются соответствующим образом спланированные сравнения, а не предположение, что текущие результаты уже выявляют различия между матерями с диабетом и без него.

Непосредственным достижением является метод, позволяющий задавать более точные вопросы о живых клетках молока. Он не подтверждает клинические испытания и не демонстрирует, что изменение этих клеток улучшает исходы у младенцев. Следующим шагом является идентификация самих меченых молекул и определение того, сохраняются ли одни и те же клеточные структуры у более крупных и разнообразных групп доноров.

Эти исследования помещают результаты визуализации в исследования производства молока, клеточного разнообразия и иммунных реакций.

Результаты исследования доступны онлайн в журнале ACS Nano.